همسانه سازی ژن رمزکننده فسفاتاز از سویه p13 باکتری pseudomonas putida جهت انتقال به باکتری pantoea agglomerans و ارزیابی کارایی باکتری تراریخته بر رشد گیاه گندم

فسفر در مقایسه با دیگر عناصر غذایی، در بیشتر خاک ها تحرک و قابلیت جذب کمی دارد. از آنجا که گیاهان فقط قادر به جذب یون فسفات آزاد از منابع فسفر آلی و معدنی می باشند، این عنصر یکی از اصلی ترین عوامل محدود کننده رشد گیاهان به شمار می رود. ریزسازواره های حل کننده فسفات نقش مهمی در تامین فسفر در قالب روش های سازگار با محیط زیست و پایدار می تواند داشته باشد. سازوکار اصلی برای رهاسازی فسفر معدنی و آلی موجود در خاک به ترتیب تولید اسیدهای آلی و آنزیم فسفاتاز توسط ریزسازواره ها می باشد. هدف اصلی این تحقیق شناسایی، جداسازی، همسانه سازی و بررسی ویژگی های آنزیمی یکی از ژن های فسفاتاز از باکتری pseudomonas putida p13 بود. به منظور همسانه سازی ژن های فسفاتاز مورد نظر از روش غربالگری کتابخانه ژنومی p. putida p13 و شناسایی ژن ها از طریق مطالعات بیوانفورماتیک استفاده شد، گرچه انجام مطالعات بیوانفورماتیک و انتخاب ژن نامزد با توجه به اطلاعات موجود در پایگاه های اطلاعاتی به منظور طراحی آغازگر موفقیت آمیز نبود، ولیکن تهیه کتابخانه ژنومی برای جداسازی ژن با استفاده از طراحی سیستم جدید غربالگری عملکردی ابداعی در محیط کشت حداقل حاوی یک سوبسترای رنگزا منجر به جدا نمودن دو همسانه مستقل از هم شد. مطالعات بعدی در راستای رسیدن به توالی رمزکننده فسفاتازها از طریق زیرهمسانه سازی با توجه به نقشه برشی آن ها و با استفاده از آغازگرها در دو طرف مناطق رمزکننده موجود در همسانه ژنومی جداشده انجام پذیرفت. پس از شناسایی منطقه رمزکننده فسفاتازها، برای بیان فراوان آن ها ژن های جداشده درون ناقلpgem-t easy در باکتری e. coli dh5? انتقال یافتند. بررسی ویژگی های آنزیمی ژن های جداشده بعد از خالص سازی پروتئین نشان داد که یکی از آنها به نام ppp1 دارای فعالیت فیتازی است و دیگری به نام ppp2 رمزکننده آنزیم فسفاتاز قندی است. بررسی های بیشتر بر روی آنزیم ها نشان داد که هر دو آنزیم فعالیت بهینه ای در 5ph و دمای 60 درجه سانتیگراد دارند. بررسی ها در حضور فیتات نشان داد که ثابت های بیوشیمیایی km و vmax برای ژن های فیتاز با وزن مولکولی kda 27 به ترتیب mm237/0 و µmol min?1 mg?1 281 و برای فسفاتاز قندی با وزن مولکولی kda50 mm192/0 و µmol min?1 mg?120 می باشد. نتایج hplc نشان داد که ژن ppp1 قادر به رهاسازی 5 گروه فسفات از 6 گروه فسفات ملکول فیتات می باشد، در حالی که ژن ppp2 تنها یک گروه فسفات را آزاد می نماید. هر دو آنزیم در دماهای بالا پایدار بوده و نگهداری در دماهای 55 و 60 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه اثری بر فعالیت آنزیم فیتاز و فسفاتاز قندی ندارد. گرچه رفتار آنزیمی و ویژگی های بیوشیمیایی این آنزیم ها با آنزیم های شناخته شده در کلاس 4 گانه فیتازی (به ویژه hapها) یا کلاس 3 گانه اسید فسفاتازهای غیر ویژه (به ویژه کلاس a) تفاوت چندانی نشان نمی دهد، اما از نظر توالی اسید آمینه، با کلاس های فوق هیچ تشابهی نشان نداده و به نظر می رسد که خود در کلاس جداگانه ای قرار می گیرند. توالی اسید آمینه ژن های جدا شده بیشتر با پروتئین های تسهیل کننده (major facilitator superfamily ) تشابه نشان می دهد. برای ارزیابی اثر باکتری های حل کننده فسفات بر رشد گیاه و جذب فسفر توسط گیاه گندم رقم روشن، آزمایش گلخانه ای در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار با اعمال 4 تیمار باکتریایی شامل باکتریp13 p. putida ،p5 p. agglomerans، p. fluorescence chao، باکتریهای p. putida بعلاوه p. agglomerans و شاهد (بدون تلقیح باکتری) در خاک استریل با بافت لوم انجام شد. تجزیه آماری بر روی صفات اندازه گیری شده، شامل وزن تر و خشک بخش هوایی، تعداد خوشه، تعداد دانه و وزن دانه، فسفر بخش هوایی در میان دوره (50 روز) و انتهای دوره رشد (120 روز) و فسفر موجود در دانه، نشان داد که تیمارهای باکتریایی در مقایسه با شاهد باعث افزایش غلظت فسفر بخش هوایی می شود، به گونه ای که تیمار حاوی دو باکتری p13 بعلاوه p5 دارای بالاترین میانگین می باشد. ولیکن اعمال تیمارها تاثیری بر افزایش بیوماس گیاهی نداشته است، هر چند که پارامترهایی نظیر تعداد خوشه یا تعداد دانه و وزن دانه در برخی از تیمارهای باکتریای دارای میانگین بالاتری نسبت به شاهد بودند.